双色超微型显微成像系统在470nm激发光的基础上增加了561nm通道，可以在同一位点同时记录绿色荧光和红色荧光的信号。当参考通道采用mCherry等红色荧光蛋白作为标记物时，该通道的信号可以作为对照数据排除运动噪音（包括光纤滑环的转动噪音），验证钙信号通道的数据有效性。参考通道的标记物亦可以换成红色钙敏感荧光探针，则利用这套系统可以同时对相关脑区的两种类型神经元在某一行为范式中的活动情况进行同步记录，用以反映同一行为范式中不同类型神经元的编码特征。